Пути биосинтеза. Как. правило, путем ингибирования конечным продук­том регулируется первый фермент данной биосинтетической последова­тельности реакций. Если в клетке происходит избыточное образование и накопление конечного продукта, то в результате торможения первого фермента деятельность всей цепи тотчас же замедляется.  В процессе биосинтеза изолейцина из треонина таким ферментом служит треонин-дезаминаза:

Регулируемые и нерегулируемые нефункциональные ферменты (изо-зимы). Следует отметить, что не всякая треониндезаминаза ингибирует-ся изолеицином. Если Escherichia coli растет в аэробных условиях на среде с глюкозой и солями аммония, то ее клетки содержат только од­ну треониндезаминазу, на анаболическую функцию которой указывает аллостерическое торможение изолеицином. Но если клетки растут в анаэробных условиях на среде со смесью аминокислот (пептон и гид-ролизат казеина), то происходит репрессия синтеза анаболической трео-ниндезаминазы и образуется изозим, обладающий катаболической ак­тивностью и подверженный аллостерическому регулированию только со стороны AMP и ADP.

Другим примером может служить образование 2-ацетиллактата в клетках Enterobacter aerogenes. Эта реакция, катализируемая синтазой ацетогидроксикислот, с одной стороны, участвует в анаэробном сбражи­вании глюкозы с образованием ацетоина (катаболизм); с другой сто­роны, с нее начинается путь синтеза валина (анаболизм). Таким обра­зом, 2-ацетиллактат является общим промежуточным продуктом разветвленной цепи реакций:

Клетки могут синтезировать два изофункциональных фермента. Один из них образуется только в том случае, если во время брожения снизи­лось значение рН и конечным продуктом является нейтральный аце-тоин. Другой фермент тоже синтезируется в нейтральной и слабощелоч­ной среде; он имеет высокий оптимум рН и подвержен аллостерическо­му подавлению валином.

Как видно из этих примеров, взаимовлияние двух путей обмена мо­жет исключаться в результате образования изозимов, активность одно­го из которых обычно строго регулируется, тогда как другой не подвер­гается регуляции того же типа.

Разветвленные пути биосинтеза. Особые проблемы возникают в тех случаях, когда на первый этап биосинтеза действуют два или большее число конечных продуктов. Если в какой-то гипотетической последова­тельности реакций А превращается в Е, G и Н, то первый этап, А -> В, будет подавляться и в случае накопления лишь одного конечного продукта (например, Н). Однако это вызовет также снижение синтеза двух других продуктов -G и Е. Подобные проблемы, возникающие при регу-

ляции разветвленных путей биосинтеза, разные организмы, видимо, раз­решили по-разному. До сих пор было найдено несколько различных ти­пов регуляции для ферментов, функционирующих на расходящихся или параллельных путях метаболизма.

• 1. Первый этап катализируется несколькими изозимами, каждый из которых регулируется особым конечным продуктом.
• 2. Первый этап катализируется одним ферментом, при этом воз­можны разные варианты: а) для ингибирования общего первого этапа все конечные продукты должны присутствовать в избытке; или б) каждый из конечных продуктов действует независимо от остальных (кумулятивное ингибирование), причем общее торможение может пре­вышать сумму отдельных эффектов (кооперативное ингибирование).

Первый этап биосинтеза аминокислот метионина, лизина, треонина и изолейцина («семейство аспарагиновой кислоты») катализируют не­сколько изозимов (рис. 16.13). У Escherichia coli в реакции

Аспартат + АТР -> Аспартил-4-фосфат + ADP

участвуют три параллельно действующие аспартаткиназы, активность которых регулируется разными конечными продуктами. Аспартаткиназу I и гомосериндегидрогеназу I ингибирует треонин. Аспартаткиназа III регулируется лизином. Аспартаткиназа II не подвержена аллостериче-ской регуляции. В регуляции аспартаткиназ участвуют еще дополни­тельные механизмы, причем в каждом случае первый фермент, специ­фичный для данного пути биосинтеза, ингибируется конечным продук­том этого пути.

Подобного рода схема регуляции существует и для «семейства аро­матических аминокислот» (см. рис. 7.17). Первый этап биосинтеза фе-нилаланина, тирозина, триптофана и 4-аминобензойной кислоты со­стоит в реакции эритрозо-4-фосфата с фосфоенолпируватом, в результа­те которой образуется З-дезокси-О-арабиногептулозо-б-фосфат (ДАГФ). У Е. coli имеются три ДАГФ-синтазы. Одна из них контролируется ти­розином, вторая - фенилаланином, а третий, малоактивный фермент не ингибируется. Дополнительная регуляция и в этом случае осуществляет­ся по принципу ретроингибирования (отрицательной обратной связи).

Фосфофруктокиназа и эффект Пастера. Эффект Пастера-торможе­ние гликолиза дыханием - можно объяснить тем, что между системами фосфорилирования в дыхательной цепи и на уровне субстрата суще­ствует конкуренция за ADP и фосфат (разд. 8.1). Согласно новейшим данным, расщепление гексоз по фруктозобисфосфатному пути контро-

лируется в первую очередь путем аллостерической регуляции активно­сти фосфофруктокиназы (рис. 16.14). Фосфофруктокиназу из пекарских дрожжей аллостерически ингибирует АТР. В присутствии АТР увеличи­вается сигмоидность кривой насыщения фермента субстратом. Очень важно то, что, хотя 5'-трифосфаты инозина, гуанозина и цитозина и мо­гут служить вместо АТР донорами фосфатных групп, они не выпол­няют ни ингибирующей, ни регулирующей функции. Это означает, что аллостерический центр фермента обладает высокой специфичностью в отношении АТР и что его сигнал однозначен. Напротив, специфич­ность каталитического центра незначительна. AMP действует как поло­жительный эффектор и снимает торможение, вызываемое АТР. Другие моно- и дифосфаты не действуют совсем или действуют очень слабо. У Escherichia coli роль положительного эффектора играет не AMP, a ADP. Фосфофруктокиназа ингибируется также цитратом; при этом АТР усиливает этот эффект, а фруктозо-6-фосфат ослабляет его.

Знание аллостерических свойств фосфофруктокиназы позволяет сде­лать следующий вывод: если аэробно растущие дрожжевые клетки или

клетки тканевой культуры лишить кислорода и приостановить таким образом окислительное фосфорилирование, то в клетке снизится соот­ношение концентраций АТР/АМР, что приведет к повышению активно­сти фермента и соответственно к ускорению реакции. То, что регуляция процессов в живой клетке действительно происходит описанным путем, удалось подтвердить, измеряя внутриклеточные концентрации глюкозы, глюкозо-6-фосфата, фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-бисфосфата и триозофосфатов до и после перехода от анаэробных условий к аэ­робным. Непосредственно после аэрирования культуры концентрация глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата возрастает, а содержание фруктозобисфосфата и триозофосфатов резко снижается. Таким обра­зом, фосфофруктокиназа действует как клапан, регулируемый аденила-тами и другими метаболитами; когда он закрыт, метаболиты, находя­щиеся «выше» него в цепи, накапливаются, а расположенные «ниже» продолжают участвовать в реакциях, и их количества уменьшаются. Это позволяет понять, почему при переходе к аэробным условиям по­требление глюкозы падает.

Глюконеогенез. Аденилаты ATP, ADP, AMP и СоА-производные жирных кислот оказывают регулирующее воздействие на многие реак­ции, участвующие в катаболизме гексоз, в промежуточном обмене и в синтезе запасных веществ. Регуляция фосфофруктокиназы служит, по-видимому, тем главным клапаном, с помощью которого регулируется поток субстрата, направляемый по фруктозобисфосфатному пути. Со­ответствующий фермент, контролирующий у некоторых бактерий рас­щепление субстрата по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути,-это, очевидно, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Ее тоже в сильной сте­пени ингибируют АТР и NADH₂.

Образование глюкозы из пирувата или лактата (глюконеогенез) играет определенную роль тогда, когда эти и другие вещества служат источниками углерода в отсутствие углеводов. Синтез идет по фрукто­зобисфосфатному пути, за исключением трех необратимых реакций (рис. 16.14). Эти этапы катализируются регулируемыми ферментами. В животных тканях путь от пирувата к фосфоенолпирувату проходит через оксалоацетат. Первая реакция катализируется пируваткарбоксила-зой и зависит от присутствия ацетил-СоА. По-видимому, ацетил-СоА играет в данном случае роль сигнала, свидетельствующего о насыщении всех реакций, использующих это соединение, в особенности реакций ко* нечного окисления через цикл трикарбоновых кислот. Такая регуляция гарантирует получение энергии и допускает синтез глюкозы лишь при избытке ацетил-СоА. Кроме того, зависимость образования оксалоаце-тата от ацетил-СоА может быть существенной для обеспечения цикла трикарбоновых кислот необходимым количеством оксалоацетата.

При глюконеогенезе реакция с участием фруктозобисфосфатазы

Фруктозо-1,6-бисфосфат + Н₂0 -> Фруктозо-6-фосфат + Pj

дает возможность обойти вторую необратимую реакцию цепи гликоли­за. Фруктозобисфосфатазу ингибирует AMP, который служит здесь ин­дикатором степени насыщения клетки высокоэнергетическими соедине­ниями. Избыток AMP означает, что поступление АТР недостаточно для насыщения реакций, связанных с затратой энергии. Кажется вероятным, что в таких условиях глюконеогенез тормозится для усиления распада глюкозы и увеличения выхода энергии.

Цикл трикарбоновых кислот. У дрожжей АТР сильно понижает срод­ство цитратсинтазы к ацетил-СоА. У Е. coli и других бактерий высокая концентрация NADH₂ сигнализирует о насыщении дыхательной си­стемы и о том, что потребление субстрата в цикле трикарбоновых кис­лот должно быть снижено. Ингибитором 2-оксоглутаратдегидрогеназы, цитратсинтазы  и  пируватдегидрогеназы  служит  NADH₂   (рис. 16.14).

Синтез запасных жиров. Запасные вещества накапливаются, как пра­вило, в тех случаях, когда источники углерода и энергии имеются в избытке, но рост клеток невозможен из-за недостатка соединение азота или серы. Сигнал к образованию жиров (жирных кислот) и полисахари­дов исходит главным образом от промежуточных продуктов. У дрож­жей реакцией, лимитирующей скорость синтеза жирных кислот, являет­ся карбоксилирование ацетил-СоА при участии ацетил-СоА-карбокси-лазы:

АТР

Ацетил-СоА + СОг---------- * Малонил-СоА

Биотин-фермент

Этот фермент занимает первое место на пути биосинтеза жирных кис­лот с длинной цепью. Другие процессы синтеза, в которых исходным соединением служит ацетил-СоА (синтез каротиноидов, стероидов, ци­трата, малата и др.), не нуждаются в активирующем воздействии мало-нил-СоА. Ацетил-СоА-карбоксилаза активируется цитратом. Повыше­ние содержания цитрата, способствуя образованию малонил-СоА, тем самым стимулирует синтез жирных кислот с длинной цепью и ней­тральных жиров (триглицеридов). Роль отрицательных эффекторов играют при этом СоА-производные пальмитиновой и других жирных кислот. При накоплении СоА-производных происходит ингибирование конечным продуктом.

Синтез запасных полисахаридов. Исходным соединением для синтеза запасных полисахаридов (гликогена и крахмала) служит глюкозо-1-фос­фат. Он активируется нуклеозидтрифосфатом (NuTP), после чего глюко-зильная группа переносится на полиглюкозную цепь:

Фосфорилаза
Глкжозо-1-фосфат + NuTP----------- *-  NuDP -глюкоза + PPj

Гликогенсинтетаза
/iNuDP-глюкоза ---------------------- *- (Глюкоза) „ +nNuDP

В то время как синтез гликогена в печени происходит с участием UDP-глюкозы, для синтеза крахмала у зеленых растений и гликогена у различных бактерий используется ADP-глюкоза. Гликогенсинтетаза печени активируется глюкозо-6-фосфатом. Регуляторные системы, имеющиеся у бактерий и растений, сильно отличаются от системы, дей­ствующей в клетках печени. Регуляция осуществляется через пирофос-форилазу. У Escherichia coli, Arthrobacter и Rhodospirillum rubrum, а также в листьях шпината AMP и ADP действуют как ингибиторы, а предше­ственники (глюкозо-1-фосфат)-как стимуляторы. Пирофосфорилаза Е. coli активируется фруктозобисфосфатом, глицеральдегидфосфатом и фосфоенолпируватом; фермент R. rubrum активируется пируватом, а фермент из листьев шпината - 3-фосфоглицератом, фосфоенолпирува­том и фруктозобисфосфатом. Синтез полисахаридов-прекрасный при­мер того, как один и тот же результат может достигаться с помощью разных регуляторных систем.

Автотрофная фиксация двуокиси углерода. Фиксация С0₂ в рибуло-зо-1,5-бисфосфатном цикле-один из метаболических процессов, тре­бующих наибольших затрат энергии. Отсюда понятно, что существуют регуляторные механизмы, обусловливающие высокую скорость этого цикла лишь в том случае, если обеспечен достаточный приток энергии для поддержания структуры и функций клетки (для синтеза мономеров и полимеров, обновления ферментов и др.). Фосфорибулокиназа подвер­жена специфической регуляции: AMP (реже ADP) ингибирует этот фер­мент, a NADH₂ активирует его.

Энергетический заряд клетки. Приведенные примеры подтверждают предположения о том, что аденилаты выполняют в клетке важные регу­ляторные функции и что они в известной степени представляют собой общие для катаболизма и анаболизма сигналы, обеспечивающие нуж­ное соотношение между получением энергии и процессами биосинтеза. Внутриклеточное содержание ATP, ADP и AMP (или, точнее, соотноше­ние между этими тремя аденилатами) определяет скорость отдельных реакций, а тем самым и сложных процессов распада и синтеза.

Было принято количественное выражение для «энергетического заряда» (ЭЗ) клетки:

2АТР + ADP                                 АТР + 0,5ADP

ЭЗ = 1/2--------------------- =------------------ .

'    ATP + ADP + AMP      ATP + ADP + AMP

Коэффициент 0,5 представляет собой произвольную величину, введенную для удобства (чтобы параметр мог варьировать в пределах от 0 до 1). Таким обра­зом, энергетический заряд клетки служит мерой ее обеспеченности высокоэнер­гетическими соединениями в расчете на общее число «аденозиновых единиц» (аденилатов). Величина его равна единице, когда весь аденилат представлен в форме АТР, и нулю, когда в клетке имеется только AMP Для клеток в экспо­ненциальной фазе роста культуры эта величина обычно близка к 0,8.

Результаты проведенных исследований позволяют предполагать, что аллостерические ферменты активируются или ингибируются тем или иным аденилатом и что именно это обеспечивает согласованную регу­ляцию всего метаболизма клетки. Если, например, энергетический заряд клетки возрастает, то активность катаболических ферментов снижается, а активность ферментов, участвующих в процессах синтеза, увеличи­вается. При уменьшении энергетического заряда наблюдается обратная картина.